自2020年10月上?？祆`發(fā)布“非洲豬瘟高敏PCR試劑盒”（下稱高敏試劑盒）以來(lái)，其出色的靈敏度、敏感性、特異性及穩(wěn)定性迅速被廣大豬場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可。隨著熒光PCR相關(guān)技術(shù)的普及以及用戶群體的增大，部分之前未被重視的問(wèn)題也逐漸顯露出來(lái)。本篇我們探討下各廠家都諱莫如深的一個(gè)點(diǎn)——“假陽(yáng)”問(wèn)題，以及相應(yīng)的解決方案。

    "假陽(yáng)”問(wèn)題，事實(shí)上在熒光PCR領(lǐng)域并不少見(jiàn)，而造成假陽(yáng)產(chǎn)生的原因也是紛繁復(fù)雜：如操作不當(dāng)污染、環(huán)境氣溶膠污染或者試劑生產(chǎn)過(guò)程污染等。本文所要探討的“假陽(yáng)”，主要指因試劑特異性導(dǎo)致的假陽(yáng)，換句話說(shuō)，即文中所提的“假陽(yáng)”，與操作者、儀器、環(huán)境均無(wú)關(guān)，只與試劑盒內(nèi)的試劑有關(guān)。那么試劑盒中到底什么與“假陽(yáng)”相關(guān)呢？縱觀商業(yè)化的非瘟病毒PCR檢測(cè)試劑盒，其中都會(huì)提及一個(gè)重要參數(shù)——特異性。

    何為特異性呢？在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，如果我們要擴(kuò)增的非洲豬瘟DNA片段在整條DNA鏈上不止出現(xiàn)了一次，或者樣品中混有的其他物種、細(xì)胞或病毒的DNA中含有類(lèi)似的DNA片段，則可能會(huì)將其他片段擴(kuò)增出來(lái)，那最后儀器顯示出來(lái)的陽(yáng)性結(jié)果就不一定是非瘟病毒DNA造成的，于是陽(yáng)性結(jié)果也就變成了假陽(yáng)。因此，通俗來(lái)說(shuō)，特異性反應(yīng)的是試劑盒能擴(kuò)增出特定DNA片段的性能，特異性越低，則試劑盒擴(kuò)增其他片段的概率就越大，即“假陽(yáng)”幾率更大。

    市售的眾多非瘟病毒PCR檢測(cè)試劑盒中，絕大多數(shù)廠商在宣傳其試劑盒特異性時(shí)均會(huì)標(biāo)注＞99%，最低也不會(huì)低于98%，快靈的高敏試劑盒也是如此，特異性可達(dá)到99.9%，屬實(shí)是已經(jīng)做到了極限，即使PCR技術(shù)發(fā)展至今，因?yàn)槟０錎NA的不確定，依然無(wú)法保證100%的特異性。也正因此，特異性，也就是假陽(yáng)的問(wèn)題是被大家忽視了。

    在服務(wù)客戶的過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)很多客戶在進(jìn)行非瘟病毒檢測(cè)遇到極弱樣本或疑似樣本時(shí)，對(duì)于陽(yáng)性場(chǎng)，往往遵循的是“寧殺錯(cuò)，不放過(guò)”，而對(duì)于陰性場(chǎng)，往往帶來(lái)心理的恐慌，需要確認(rèn)到底是不是陽(yáng)性。的確，隨著非瘟一波波的襲來(lái)，各檢測(cè)單位的工作量都史無(wú)前例的倍增，再重新來(lái)一遍的全面復(fù)核，顯然是對(duì)人力和成本的巨大考驗(yàn)。面對(duì)這樣的大環(huán)境，快靈人陷入了沉思。

    “我們?yōu)槭裁匆獙帤㈠e(cuò)？”

    “當(dāng)真沒(méi)有辦法消除假陽(yáng)么？”

    帶著這樣的問(wèn)題，我們開(kāi)始了新的一輪又一輪的嘗試：提升試劑盒的靈敏度、將特異性由99%提升至99.9%……或許，我們可以把眼界放寬，不局限于單純的擴(kuò)增？

    于是，高敏試劑盒上市半年后，我們?cè)诟呙粼噭┖谢A(chǔ)之上研發(fā)出其“升級(jí)版”——快靈高敏試劑盒（熔解確認(rèn)版）。

    快靈高敏試劑盒（熔解確認(rèn)版），其性能參數(shù)與高敏試劑盒一致，我們同樣保證其靈敏度、敏感性、穩(wěn)定性、特異性處在行業(yè)頂尖水平，確?？蛻艨梢缘谝粫r(shí)間檢測(cè)出陽(yáng)性樣本。包括其操作、擴(kuò)增階段也與高敏試劑盒別無(wú)二致，至此，我們可以把快靈高敏試劑盒（熔解確認(rèn)版）等同于高敏試劑盒。詳見(jiàn)表1：

    但，重點(diǎn)來(lái)了！快靈是怎么做到的？快靈高敏試劑盒（熔解確認(rèn)版）突破性地使用了一個(gè)新的反應(yīng)程序——熔解曲線。熔解曲線能鑒別不同的DNA片段，依靠的不是Ct.值，而是其特有的熔解峰，即Tm值，即使一個(gè)DNA片段中僅相差一個(gè)堿基，都能導(dǎo)致Tm值變動(dòng)。依靠Tm值的判定就可以確認(rèn)之前擴(kuò)增陽(yáng)性的非瘟樣本是否為真的非瘟陽(yáng)性，以此達(dá)到鑒別假陽(yáng)，消除客戶疑慮的目的。

非瘟新形勢(shì)下，除了要求試劑盒更早的檢測(cè)出陽(yáng)性，更需要真正“精準(zhǔn)”檢測(cè)?？祆`高敏試劑盒（熔解確認(rèn)版）除了超高的靈敏度、特異性，更是“自帶”熔解曲線，讓假陽(yáng)無(wú)處可藏，讓弱陽(yáng)“站得住腳”，真正做到打消客戶疑慮，真正做到“不殺錯(cuò)、不放過(guò)”。

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